Dne 11.3.2019 jsme měli tu čest a mohli přednášet pro studenty 5. a 6. ročníku na semináři o laboratorní diagnostice, který pořádala IVSA. Studenty jsme požádali, aby nám napsali, které informace ze semináře považovali za nejpřínosnější a o ty se s Vámi v tomto článku podělíme. Přednášejícím byla autorka textu MVDr. Ivana Váňová, PhD.

Celkem zaujalo studenty 20 informací, které se ve zkratce dozvíte níže:

  • 1. Jakou dezinfekci zvolit pro odběr krve?
  • 2. Individuální referenční hodnoty – ano nebo ne?
  • 3. Variabilita referenčního rozmezí aneb co dělat s nečekaným nálezem
  • 4. Plemenné odlišnosti v referenčním rozmezí

    O laboratorní diagnostice v podzemí. Foto IVSA.

  • 5. Krevní nátěr
  • 6. Hemokultivace – ano nebo ne?
  • 7. Nepřímý Coombsův test
  • 8. Jak stanovit ionizovaný vápník
  • 9. Kreatinkináza u neurologických onemocněních a koček
  • 10. Může být zvýšený nekonjugovaný bilirubin u onemocnění jater?
  • 11. Jaká je kinetika jaterních enzymů?
  • 12. Záludnosti stanovení specifické pankreatické lipázy
  • 13. Nové studie SDMA u psů
  • 14. Onkomarker alfa-fetoprotein
  • 15. Euthyroid sick syndrom
  • 16. Ekvilibrační dialýza pro stanovení volné T4
  • 17. Hyperthyreóza u “BARFujících” psů
  • 18. Doporučený diagnostický algoritmus pro hyperadrenokorticizmus
  • 19. Protilátky proti 2M proteinu
  • 20. Diagnostika onemocnění srdce
1. Jakou dezinfekci zvolit pro odběr krve?
Dezinfekce je nepřítel krve, jelikož při kontaminaci (např. jehly) dochází ke vzniku hemolýzy. Kontraproduktivní je také to, že většina běžné dezinfekce není účinná při způsobu, jakým běžně krev odebíráme – účinnost je totiž spojená s delší dobou lokálního působení. Pokud bychom se podívali na oblíbené dezinfekce, tak u Ajatinu výrobce uvádí nutnost zaschnutí přípravku a např. u Betadine je pro kožní použití nutné nechat působit 1-2 minuty. Na workshopech se zahraničními přednášejícími jsme běžně viděli přípravu místa odběru pouze pomocí vody (zejm. kvůli viditelnosti pod srstí). Jako vhodný kompromis můžeme použít alkohol, který se rychle odpařuje a ještě nám pomůže lokálně vazodilatací. Pravda, nevypadá tak pěkně barevně, to však můžeme kompenzovat barvou Cobanu 🙂
2. Individuální referenční hodnoty - ano nebo ne?
Obecně se má za to, že individuální referenčí hodnoty jsou vhodné pro parametry, kde je denní variabilita u jedince menší než je variabilita v populaci. Čím specifičtější populaci pro referenční hodnoty máme, tím méně vzniká potřeba referenčních hodnot pro jednotlivce – bohužel, nejníže v hierarchii se zatím dostaneme na úroveň (několika málo) plemen. Klientům je vhodné doporučit stanovení individuálních referenčních hodnot u psů od věku 2 let a ideálně je každoročně sledovat. Parametry volíme zejména ty, u kterých je nízké riziko ovlivnění externími podmínkami (např. krmením). Za vhodného kandidáta se považuje např. kreatinin (vzhledem k širokému ref. rozmezí), za nevhodného glukóza. Více info v angličtině: zde.
Název spoileru
Referenční hodnoty jsou (v nejlepším případě) generovány na populaci minimálně 120 jedinců. Ve veterinární medicíně to tak většinou není a to zejména u exotických zvířat. Za ideálních podmínek máme velkou skupinu klinicky zdravých středně starých zvířat, u kterých testujeme daný parametr. Po získání výsledků (ideálně ve stejný čas a za stejných podmínek) vyloučíme odlehlé hodnoty. V dalším kroku provedeme statistické analýzy, které jsou převážně založeny na ponechání 95 % hodnot (tj. odstranění 2,5 % výsledků z obou konců). Důsledkem těchto statistických metod je, že dojde k vyloučení hodnot psů, které považujeme za zdravé. Praktickým dopadem a statisticky pravděpodobné je to (pokud stanovujeme 20 paramterů), že jeden pes bude mít hodnoty mimo referenční rozmezí. Jak to poznáme? Obvykle se jedná o hodnoty, které jsou blízko referenčního rozmezí, nejsou spojeny s jiným patologickým laboratorním nebo klinickým nálezem a/nebo jejich případný nález může být vysvětlen preanalytickou variabilitou.
4. Plemenné odlišnosti v referenčním rozmezí
Existuje několik studií hodnotících specifické plemenné referenční hodnoty. Některé z nich vedou pouze k zúžení referenčního rozmezí, jiné k rozšíření nebo dokonce jeho posunu. Obecně lze konstatovat, že plemenné referenční hodnoty jsou důležité a neznámé. Z tohoto důvodu lze doporučit stanovení individuálních hodnot pro jednotlivé jedince. Výčet všech plemenných specifik je nad rámec tohoto článku, ale chystáme se na ně! Pokud Vás zajímá konkrétní plemeno, napište nám ho do komentáře.
5. Krevní nátěr
PPokud vzorky zasíláte do distanční laboratoře, laborant(k)y potěší určitě jakýkoliv nátěr, ale samozřejmě nátěr do 2/3 skla s “ocáskem” potěší nejvíc. Morfologie transportovaných buněk opravdu trpí, řadu morfologických abnormalit erytrocytů pak není možné hodnotit a navíc dochází ke shlukování trombocytů. Zda provedete nátěr z nativní krve ve stříkačce nebo z krve z EDTA zkumavky ihned po odběru je jedno. V tak krátkém intervalu k žádné relevantní změně nedojde.
6. Hemokultivace - ano nebo ne?
Největším problémem hemokultivace je stabilita kultur v hemokultivační láhvi. Pokud není mikrobiologická laboratoř v krátkém dosahu (např. 2 h) je nutné vždy počítat s možností falešně negativních výsledků. Dle typu láhve je obvykle tolerována jejich “inkubace” při pokojové teplotě do 24 h. Zdá se, že nižší teplota je vůči kultivaci šetrnější, než inkubace láhve při 37°C (Sautter a kol.). Co se týká výtěžnosti, tak v humánní medicíně se jako problematická jeví izolace Pseudomonas aeruginosa. Střípky zvířecích modelu ukazují, že mírá falešné negativity při hemokultivaci může být značná (Cursons a kol., Heininger a kol.). Že nejsme moc specifičtí? To bohužel ani námi nalezené studie.
7. Nepřímý Coombsův test
Nepřímý Coombsův test se ve veterinární medicíně užívá minimálně. Jednou z indikací je podezření na imunitně-zprostředkovanou destrukci erytrocytů (retikulocytů) na úrovni kostní dřeně, kdy je absence znaků regenerace v periferní krvi a současně je v kostní dřeni zvýšená erytropoéza. Přesnější výsledky jsou získány v případě provádění nepřímého Coombsova testu ze vzorku kostní dřeně. 
8. Jak stanovit ionizovaný vápník
Ionizovaný vápník je frakce z celkového vápníku v krvi, který není vázán na bílkoviny a představuje aktivní “pool”. Jelikož je vazba na albumin závislá od pH je pro jeho přesnou hodnotu nutné odebrat vzorek anaerobně. Použít k tomu lze vacutainerové zkumavky, přičemž celou proceduru provádíme co nejvíce anaerobně (tj. odběr jehlou, vložení do zkumavky jehlou, separace séra jehlou a přesun do další vacutainerové zkumavky). Anaerobně odebraný vzorek pro iCa je stabilní 3 dny při pokojové teplotě, 7 dní při -10°C, nevadí mu transport na ledu (např. při acidobazickém vyšetření), nevadí mu kontakt se vzduchem v laboratoři těsně před analýzou. Hodnoty však ovlivní přítomnost vzduchové bubliny v stříkačce při odběru (Schenck a kol.).
Název spoileru
Hladina kreatinkinázy se kromě onemocnění svalů, drobných změn při infekčních kardiomyopatiích (nebo výrazných změn u fatálních ischemií myokardu) zvyšuje také při různých neurologických onemocněních – idiopatické epilepsii, SRMA a dalších. Tento vzestup je obvykle 7-10násobný a jeho důvodem je elevace izoenzymu v nervové tkáni (CK-BB) a ne svalové, jak bychom mohli u epilepsie předpokládat (Schenck a kol.). Poměrně neočekávaným nálezem může být pro některé elevace CK u hladovějících koček (tento fenomén není popsán u psů). Průměrné hodnoty jsou až 3000 U/l, přičemž maximum bylo 153000 U/l. Tyto hodnoty korelují s elevací AST a LDH a 48 h po obnovení krmení dochází k jejich poklesu. (Fascetti a kol.)
10. Může být zvýšený nekonjugovaný bilirubin u onemocnění jater?
Nekonjugovaný, nepřímý, bilirubin je bilirubin který pochází z degradace hemu a nedošlo ještě k jeho zpracování játry. Zdálo by se, že by mohl být nápomocný při odlišení prehepatálního a hepatálního ikteru, nemusí to však vždy být pravdou. Jelikož se v játrech tvoří membrána erytrocytu, jsou chronická onemocnění  jater spojena se zvýšenou fragilitou erytrocytů. V důsledku snížené osmotické rezistence může docházet k mechanické destrukci erytrocytů a tím zvýšení nekonjugovaného bilirubinu.
11. Jaká je kinetika jaterních enzymů?
V důsledku relativně krátkých poločasů rozpadů jaterních enzymů je možné na základě pravidelného monitoringu sledovat progresi jaterních onemocnění. Má se za to, že poločas rozpadu ALT je 59 hodin a AST 22 hodin, u koček jsou tyto hodnoty ješte mnohem kratší (eclinpath). V klinické praxi je však možné pozorovat i mnohem dramatičtější posuny. Jako příklad uvedeme kazuistiku pravděpodobně otravy houbami u 2letého psa (Kook a kol.):  ALT kleslo z hodnoty 6799 U/l (norma do 93) během 24 hodin na 2365 U/l, 7. den bylo 1917 U/l, 14. den 308. AST kleslo z hodnoty 8380 U/l (norma do 44) na 691 během 24 hodin a 7. den bylo v referenčním rozmezí.
12. Záludnosti stanovení specifické pankreatické lipázy
Specifická pankreatická lipáza je oblíbený parametr pro “diagnostiku” pankreatitidy. Senzitivita testu cPLI (‘mokré’ chemie) pro vyloučení pankreatitidy byla 90 %, SNAP testu 100 %, specifita cPLI 82 %, SNAP 71 %. Pro potvrzení diagnózy se specifita a senzitivita obou testů pohybuje v rozmezí 74-81 % (Cridge a kol.). Jiná studie odhalila, že pokud je prezentován pes se symptomy akutního abdomen, až 60 % psů s jiným onemocněním než pankreatitidou má pozitivní pankreatickou lipázu. Samozřejmě, nelze vyloučit, že u těchto onemocnění není pankreas iritován, stanovit však diagnózu pouze na základě hodnoty pankreatické lipázy by bylo nevhodné. Taktéž je nutné počítat s tím, že více než 10-20 % rychlotestů je falešně pozitivních (oproti laboratornímu výsledku pankreatické lipázy a nemoci psa) (Haworth a kol.). Na závěr dobrá zpráva –  zdá se, že pankreatickou lipázu je možné měřit u psů i těsně po krmení (Steiner a kol.).
13. Nové studie SDMA u psů
SDMA je relativně nový ukazatel onemocnění ledvin u psů, kde původní studie prokázaly dřívější elevaci parametru oproti kreatininu u psů a koček s onemocněním ledvin. Průměrný čas, za který byl SDMA zvýšen oproti kreatininu byl u psů 10 a u koček 17 měsíců (Hall a kol.)(Hall a kol.). U greyhoundů mohou být jejich fyziologické hodnoty až 19,9 μg/dL (průměr 13 μg/dL) (Liffman a kol.). Zajímavé je, že recentní studie nepotvrdila výhodu měření SDMA oproti kreatininu v souvislosti s poklesem glomerulární filtrace. Výsledky však favorizují kreatinin a/nebo SDMA oproti cystatinu C (Pelander a kol.). Update od Dr. Kovaříkové: SDMA je rovněž zvýšeno u birem.
14. Onkomarker alfa-fetoprotein
Alfa fetoprotein je nespecifický onkomarker, který se používá zejména pro diagnostiku karcinomu jater. Hodnoty u zdravých psů byly pod 70 ng/ml, 75 % psů s hepatocelulárním karcinomem mělo hodnoty nad 1400 ng/ml. Psi s jiným onemocněním jater než hepatocelulární karcinomem měli hodnoty v 90 % pod 500 ng/ml. Psi s jinými tumory než tumory jater měli hodnoty AFP pod 500 v 76 % případů (Yamada a kol.). Jiná studie poukazuje na fakt, že existují hepatocelulární karcinomy, které nejsou spojeny s produkcí AFP (Kitao a kol.).
15. Euthyroid sick syndrom
Pojmem euthyroid sick syndrome se označuje stav, kdy dochází k poklesu tyroxinu při převážně normálních hodnotách TSH v důsledku non-thyroidálních onemocnění. Diagnostiku komplikuje fakt, že kinetika TSH v průběhu syndromu může imitovat hypothyreózu, neboť ve fázi rekonvalescence může být TSH i mírně zvýšeno (McDermott). Důležitou informací je, že diagnózu hypothyreózy nestanovujeme pouze na základě hodnoty celkového tyroxinu. Vždy je nutné stanovit i TSH. Čím vyšší je hodnota T4 při současné absenci protilátek, tím vyšší je pravděpodobnost, že se jedná o euthyroid sick syndrom (Nelson). Hledisko terapie euthyreózních psů je kontroverzní, avšak nejsou studie podporující benefit této medikace.
16. Ekvilibrační dialýza pro stanovení volné T4
Ekvilibrační dialýza pro stanovení volného tyroxinu umožňuje jeho přesné stanovení vyblokováním interference thyroglobulinových protilátek. Ty mohou diagnosticky relevantně změnit výsledek až u cca 30 % pacientů. Přistupujeme k ní v případě, že pacient je suspektně hypothyreózní, ale celkový i volný tyroxin má v normě (Randolph a kol.).
17. Hyperthyreóza u 'BARFujících' psů
Sporadicky se setkáváme s hyperthyreózou psů, u nichž je z jednou z nejčastějších příčin nutriční thyreotoxikóza vznikající kontaminací diety tkání štítné žlázy. Psi mají vyšší hladiny thyroxinu, dominantní příznaky jsou Pu/Pd a ztráta hmotnosti. Tento stav je reverzibilní po ukončení krmení diety (Broome a kol.).
18. Doporučený diagnostický algoritmus pro hyperadrenokorticizmus
V současné době máme k dispozici tři testy které souvisí s diagnostikou hyperadrenokorticizmu (HAC):

  • poměr kortizol:kreatinin v moči (UCCR),
  • supresní test s nízkou dávkou dexamethazonu (LDDST),
  • ACTH stimulační test.

Zjednodušeně můžeme konstatovat, že UCCR je test vhodný pouze k vyloučení hyperadrenokorticizmu. Neexistuje diskriminační hodnota pro odlišení HAC a jiného onemocnění! Jakkoliv je hodnota vysoká, nezvyšuje to specifitu testu. Zcela jasně je to vidno na grafu s patřičnou citací:

Z hlediska potvrzení diagnózy si můžeme s čistým svědomím vybrat mezi ACTH stimulačním testem a LDDST. Konsenzus ACVIM doporučuje pro diagnostiku HAC LDDST. Tento test má lepší negativní prediktivní hodnotu (96 %) než ACTH stimulační test a zároveň můžeme mít štěstí i na lokalizaci tumoru (pokud provedeme oba post-aplikační odběry). Lepší negativní prediktivní hodnota znamená, že pokud pes vyjde negativně, je méně pravděpodobné, že má HAC. V případě pozitivního výsledku je ideální u psů s nejednoznačnou klinikou nebo laboratorními nálezy potvrdit diagnózu ACTH stimulačním testem, který má o cca 15 % lepší pozitivní prediktivní hodnotu. Pokud pes vykazuje příznaky HAC a testy vychází negativně, je vhodné je zopakovat za 3-6 měsíců nebo popřemýšlet nad okultním/atypickým HAC nebo krmivem indukovaném HAC. A jelikož jsme HAC věnovali celý týden, nezapomeňte, že provedení LDDST u koček se od psů liší. Pro ty, co mají rádi schémata:

19. Protilátky proti 2M proteinu
Protilátky proti 2M proteinu jsou neinvazivní metodou detekce myozitidy masseterů u psů a koček. Falešně negativní výsledky se vyskytují zejména v pozdních stadiích onemocnění, kdy jsou vlákna 2M zničena. Výška titru není prognosticky přínosná. Protilátky jsou pro onemocnění vysoce specifické (Blazejewksi a kol.).
20. Diagnostika onemocnění srdce
V rámci diagnostiky onemocnění srdce jsou indikované pro detekci poškození kardiomyocytů troponiny. Klinicky relevantní vzestup CK, AST nebo LDH není obvykle pozorovaný, výjma infekční kardiomyopatie. Pro diagnostiku objemového přetížení se stanovují natriuretické peptidy, které jsou vylučovány zejména kardiomyocyty komor při jejich natažení. Dobře korelují s klinickým stavem pacienta a mohou nám sloužit k podpoře rozhodnutí o medikaci pacientů s vrozenými srdečními onemocněními s nejednoznačnou klinikou.
BONUS: C-reaktivní protein

C-reaktivní protein je nespecifický marker zánětu různého původu. Důvodem jeho nízké specifičnosti je to, že je jeho syntéza stimulována nejčastějšími prozánětovými cytokiny. CRP je stejně jako u lidí hlavním proteinem akutní fáze u psů, u koček pak z důvodu dostupnosti volíme sérový amyloid A (trochu vhodnějším proteinem akutní fáze je alfa-1-kyselý glykoprotein, ten se však komerčně běžně neposkytuje z důvodu náročnosti metody detekce). Mýtem v laické veřejnosti je fakt, že se CRP zvyšuje pouze u bakteriálních onemocnění. Není to pravda ani u psů, ani u lidí, avšak důvodem jeho měření pro posouzení vhodnosti použití antibiotik u lidí je pravděpodobně fakt, že pokud je u jiné než bakteriální infekce CRP zvýšené, je antibiotické krytí vhodné pro riziko sekundární infekce. Ve veterinární medicíně nemůžeme od CRP očekávat zázraky. Má dva hlavní důvody stanovení: prvním z nich je rychlejší kinetika oproti leukocytům a tudíž umožňuje rychlejší reakci na terapeutické intervence (v tomto případě je výhodou i jeho stabilita oproti buněčným elementům) a druhou je pomoc při odlišení např. myeloidních leukemií od zánětu, kdy nízké hodnoty CRP favorizují onkologické onemocnění. Při jeho hodnocení je důležité vědět dvě věci: chirurgické zákroky fyziologicky zvyšují CRP a tudíž není vhodný pro monitoring raných pooperačních komplikací; a druhá informace je ta, že struktura psího a humánního CRP je odlišná a proto pouze některé kity křížově reagují (dokonce je to věc šarže a ne metody). Proto je velice nevhodné měřit psí CRP humánním kitem “na vlastní pěst”.